IPS诱导肠类器官的培养过程可以划分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导，以及类器官的培养。本文将重点阐述第一阶段——人多能干细胞的培养。

人多能干细胞的培养

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：

• （1）在2-8℃下解冻hPSCMediumSupplement，融化后轻轻摇动混匀，根据需要分装，立即使用或存储于-20~-80℃，以避免反复冻融。
• （2）按1:50的比例，将10mL的hPSCMediumSupplement加入500mL的hPSCMediumBasalMedium中，充分混合后即为人多能干细胞培养基（abs9403）。注意：混合后的培养基可在2-8℃下稳定保存2-3周，建议不使用超过3周的培养基。
• （3）实验试剂需平衡：人多能干细胞培养基在使用前应放置于室温避光平衡；PBS和消化液等需加热至37℃。需注意的是，培养基中含有因子，切勿以水浴加热至37℃。

二、操作方法

以下步骤均需在无菌条件下进行。

hPSC细胞复苏：

• 1. 基质胶包被培养板：取出6孔板/12孔板，向每孔中加入1mL/0.5mL基质胶（abs9410），轻轻晃动使基质胶完全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1~2小时，实验前拿出并在超净工作台/生物安全柜内平衡20分钟。如不立即使用，可用Parafilm封口后于2-8℃储存，务必在1周内用完。注意：一支冻存的干细胞数量约为1×106 cells/mL，足以对应6孔板的1孔；基质胶对温度敏感，需即用即拿，使用后应迅速放回4℃冰箱并避免手直接接触。
• 2. 先将2~3mL的人多能干细胞培养基加入15mL离心管中备用。
• 3. 解冻：将冻存管从液氮中快速取出，浸入37℃温水中，快速摇动，确保在1~2分钟内快速解冻。注意：从液氮中取出细胞的速度要快，以减少在室温下的暴露时间。
• 4. 离心：冻存液解冻后，逐滴加入含有培养基的15mL离心管中，将其放入低速离心机中平衡后，以1000rpm离心3分钟。
• 5. 重悬：离心后弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基，对沉淀的干细胞进行吹吸混匀，重复3~5次。
• 6. 接种：将平衡后即用的基质胶弃掉，把均匀的干细胞悬液加入包被后的6孔板中，每孔补全至2mL的培养体系。
• 7. 培养：接种后的6孔板应在倒置相差显微镜下观察细胞密度和团块大小，4个以上细胞团块为合格。轻轻晃动板子使细胞均匀分布，并放入37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，第二天观察细胞贴壁情况。
• 8. 换液：自复苏之日起，每24小时更换一次培养基。需注意培养基中的活性成分仅能维持24小时，需及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞传代

• 1. 清洗：吸掉原有培养基，慢慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻摇晃，然后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液。
• 2. 消化：在6孔板中加入2mL的细胞消化液（abs9409），使其覆盖皿底，并放入37℃培养箱中消化2~5分钟。消化时间可根据细胞生长的密度调整，在显微镜下观察消化情况，若观察到细胞间出现间隙则可吸掉消化液终止消化。
• 3. 吹打：消化液吸掉后，加入2mL人多能干细胞培养基，轻柔地在皿底吹打3~5次以使细胞脱落，随后将其转移至15mL离心管中。需避免形成单细胞，若少量细胞未能脱落属正常情况，如有大量细胞无法脱落则需延长消化时间。
• 4. 离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。
• 5. 接种：用干细胞培养基轻轻吹打细胞5-10次，吸掉培养板中的基质胶，并将细胞悬液加入到培养板中，补全至每孔2mL的培养体系。需注意轻柔吹打，且次数不超过10次。
• 6. 换液：自传代之日起，每24小时换液一次，确保使用新鲜培养基。

hPSC细胞冻存

• 1. 清洗：同上步骤。
• 2. 消化：同上步骤。
• 3. 吹打：同上步骤。
• 4. 离心：同上步骤。
• 5. 重悬：离心后弃去上清，加入2mL的iPS细胞冻存液（abs9412）进行吹吸混匀后，转移至冻存管中。
• 6. 记录：在冻存管上标记细胞种类、时间、操作者及细胞批次。
• 7. -80℃冰箱冻存：冻存管置于-80℃冰箱过夜，需将冻存管直立放置，切忌倾斜或横放。
• 8. 液氮冻存：24小时后将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中进行长期冻存。

在进行细胞培养和冻存的过程中，确保每一步都在严格的无菌条件下进行，以达到最佳的细胞生长效果和成功率。选择尊龙凯时的高品质细胞培养产品，将大大提高你的实验效率。